COVID-19 : COME AGISCE L’OZONO VERSO I VIRUS ED IL LORO GENOMA

Iniziamo con un’analisi approfondita sull’azione dell’ozono verso i virus ed il loro genoma.

Uno studio molto approfondito sull’ inattivazione del poliovirus da parte dell’ozono e dell’impatto dell’ozono sul genoma virale ci fornisce tutti i dati a noi necessari. (Biomed Environ Sci, 2019; 32(5): 324-333 doi: 10.3967/bes2019.044)

Il poliovirus (PV), l’agente eziologico della poliomielite, invade il sistema nervoso centrale e distrugge le cellule nervose motorie

il corno anteriore del midollo spinale, provocando di conseguenza la paralisi degli arti.

In rari casi, può persino causare la morte paralizzando i muscoli che controllano la gola o la respirazione [1].

Il poliovirus (PV) è stato uno dei patogeni più temuti nei paesi industrializzati durante il 20 ° secolo, colpendo centinaia di migliaia di bambini ogni anno attraverso epidemie durante i caldi mesi estivi.

Sebbene esistano vaccini altamente efficaci per controllare la poliomielite, rimane endemica in alcuni paesi, da cui la diffusione e le epidemie continuano a verificarsi in tutto il mondo [2-4].

Il poliovirus (PV) è un enterovirus e si trasmette principalmente per via fecale-orale e orale-orale [1].

Può essere escreto attraverso le feci dei pazienti, fluendo nell’ambiente acquatico e di conseguenza si diffonde attraverso l’acqua.

La resistenza mostrata dagli enterovirus nell’ambiente acquatico (compreso il tempo di sopravvivenza e la resistenza a varie misure di purificazione e disinfettanti) è radicalmente più forte di quella mostrata dai batteri [5].

Lukasik et al. hanno valutato i livelli di efficacia di vari disinfettanti nel ridurre o eliminare completamente batteri e virus vitali dalle superfici delle fragole e hanno riferito che per ottenere la disinfezione erano necessarie concentrazioni di cloro libero fino a 300 ppm nell’acqua di lavaggio [6].

Anche dopo che la disinfezione e gli agenti contaminanti sono entro livelli accettabili nell’acqua, a volte possono ancora essere rilevati virus, di cui gli enterovirus sono i più comuni. È stato riferito che un individuo ha bisogno di ingerire una sola unità di virus rilevabile per sviluppare un’infezione [7-10].

L’utilizzo di metodi di disinfezione approfonditi è l’unico modo efficace per sradicare completamente i patogeni nell’acqua e quindi controllare le infezioni; è quindi imperativo studiare l’efficacia dei diversi metodi di disinfezione dell’acqua per contrastare agenti patogeni come il Poliovirus di tipo 1 (PV1).

L’ozono ha forti proprietà ossidanti ed è stato ampiamente utilizzato negli ultimi anni per disinfettare l’acqua potabile [11-12].

La velocità di disinfezione è molto elevata e l’effetto di inattivazione dell’ozono è migliore di quello di disinfettanti come cloro, clorammine e biossido di cloro (ClO2); L’ozono può anche ossidare e degradare le sostanze organiche presenti nell’acqua [13-15].

L’ozono rimanente nell’acqua può decomporsi naturalmente in modo che il contenuto di ossigeno disciolto nell’effluente sia elevato, il carico sul corpo idrico ricevente sia ridotto e la qualità dell’acqua possa essere migliorata [16-17].

Roy et al. ha riferito che l’ozono danneggia due delle quattro catene polipeptidiche presenti nel capside virale di PV1; tuttavia, l’alterazione del rivestimento proteico non compromette in modo significativo l’adsorbimento del virus né altera l’integrità delle particelle virali; il danno agli acidi nucleici virali da parte dell’ozono è stato il motivo principale per l’inattivazione di PV1 [18].

Considerando le diverse funzioni di ciascuna regione degli acidi nucleici virali, le sequenze bersaglio nel genoma di PV1 possono essere segregate in una regione 5′-non codificante (NCR), regione codificante, 3′-NCR e coda poli (A) [ 19].

Disinfezione tramite ozono

La sospensione virale è stata aggiunta a 100 mL di campione di acqua a 20 ° C e accuratamente miscelata per ottenere una concentrazione di 106 unità formanti placca (PFU) / L.

La portata dell’ozono era di 0,5 L / min e il tempo di ventilazione era impostato su 0, 30, 60, 90, 105 e 120 s [24].

La sospensione virale sterilizzata con ozono è stata collegata alle cellule Vero per rilevare eventuali virus vivi nel campione.

La concentrazione di ozono nel campione di acqua in ogni punto temporale è stata misurata con il metodo sopra e sono stati utilizzati tre replicati per ogni punto temporale.

Infezione da PV1

La sospensione virale sterilizzata è stata diluita e inoculata in un pallone di coltura cellulare da 25 cm2 contenente un singolo strato di cellule Vero; tre repliche sono state utilizzate per ogni timepoint.

Dopo aver miscelato 2 × 1640 terreno di mantenimento e 2% di agar in volumi uguali, è stato aggiunto a un pallone di coltura cellulare per coprire le cellule per formare un mezzo solido e il numero di placche formate è stato contato dopo 2 giorni di incubazione in una coltura cellulare incubatrice.

La concentrazione di PV1 è stata successivamente calcolata dal numero di placche formate ed espresse come PFU.

Nella formula sopra, P rappresenta il numero di placche formate, n è il numero di matracci di coltura cellulare e v è il volume di inoculo (mL).

RISULTATI

Relazione tra l’inattivazione di PV1 da ozono e lesioni antigeniche

La concentrazione di ozono nell’acqua (mg / L) è aumentata con l’aumentare del tempo di ventilazione e la concentrazione è diventata stabile dopo la saturazione (Tabella supplementare S4, disponibile su www.besjournal.com).

Poiché nel corpo idrico contenente PV1 erano presenti sostanze dannose per l’ozono, la concentrazione di ozono nell’acqua era 0 mg / L quando è stata avviata la ventilazione.

Quando è stato raggiunto l’equilibrio, la concentrazione di ozono è aumentata con il tempo di ventilazione.

Sono stati osservati effetti dipendenti dal tempo e dalla dose dell’ozono sull’inattivazione di PV1 e sul danno antigenico.

Un aumento della concentrazione di ozono o del tempo di ventilazione ha determinato una diminuzione del tasso di sopravvivenza di PV1 e un aumento del grado di lesione antigenica (Figura 1).

Il tempo necessario all’ozono per inattivare PV1 è stato molto breve: PV1 è stato completamente sradicato dall’ozono dopo aver disinfettato l’acqua per 105-120 s (Tabella supplementare S5, disponibile su www.besjournal.com).

Validazione dei primer

I primer progettati per amplificare il genoma PV1 a lunghezza intera sono stati convalidati mediante RT-PCR utilizzando come stampo l’RNA PV1 (nativo) non trattato. Tutti gli obiettivi previsti,

6 frammenti lunghi e 3 brevi sono stati amplificati con successo (Figura supplementare S1, disponibile su www.besjournal.com). Inoltre, le 6 sequenze di frammenti lunghi sono state verificate mediante sequenziamento e allineamento alla regione 7441-nt, che è stato dimostrato da BLAST essere identiche a quelle pubblicate in precedenza [28].

Effetto dell’ozono sull’infettività e sull’integrità genomica di PV1

L’infettività PV1 è stata completamente inibita dopo aver disinfettato il campione di acqua con ozono per 105 s.

Quando campioni di acqua esposti a tempi di disinfezione diversi sono stati sottoposti separatamente a RT-PCR per studiare il genoma di PV1, sono state rivelate sensibilità all’ozono specifiche della regione.

La prima regione persa per il rilevamento è stata la regione 1-1,297 nt nel 5′-NCR (Figura 2). Sono stati condotti ulteriori studi per chiarire la relazione tra il danno al genoma di PV1 e le modifiche all’infettività virale, ei risultati ottenuti hanno mostrato che la regione 1-124 nt era danneggiata (Figura 3).

Con l’aumento della concentrazione di ozono o del tempo di disinfezione, altre regioni del genoma sono state danneggiate dopo 120 s di disinfezione.

Questi risultati hanno indicato che diverse regioni del genoma di PV1 hanno una diversa resistenza all’ozono.

La regione 1-124 nt era la più sensibile e il suo danno era coerente con la scomparsa dell’infettività PV1.

Il resto del genoma ha mostrato una maggiore resistenza e il danno ad altre regioni, come evidente dai dati presentati nella Tabella 1, non era completamente coerente con le modifiche all’infettività PV1.

Queste osservazioni hanno indicato che l’inattivazione di PV1 indotta dall’ozono si verifica tramite danni alla regione 1-124 nt nel 5′-NCR.

Figure 1. (A) Ozone-induced changes of PV1 inactivation rate. (B) Dissolved concentration curve of ozone in 100 mL distilled water and 100 mL PV1-containing water. The baseline conditions were: initial concentration of PV1 was 106 PFU/L in 100 mL water sample, ventilation flow was 0.5 L/min, and temperature was 20 °C.

Table 1. Damage to PV1 RNA by Different Concentrations of Ozone

Ventilation Ozone Concentration Nucleic Acid Region (nt)
Time (s) (mg/L) Infectivity 1-1,297 1-124 108-679 669-1,274 939-7,441
0 0 + + + + + +
30 0.60 + + + + + +
60 1.08 + + + + + +
90 1.44 + + + + + +
105 1.44 + + +
120 1.44

Note. +, Positive result; -, Negative result in replicate experiments (= 3).

Figure 2. Detection of RT-PCR products in virus-containing water samples sterilized by ozone at different times. (A) The RT-PCR products of PV1 cDNA synthesized with random primers. (B) The RT-PCR products of PV1 cDNA synthesized with oligo-dT primers. Lanes 1-6 were Positive controls, correspond to the amplification products of primer set 1 to primer set 6, respectively. Lanes 7-12: Disinfection time  of  105 s, lanes 13-18: Disinfection time of 120 s, lane 19 was a negative control for primer set 1. Lanes MA and MB, DL2000 DNA markers (2,000, 1,000, 750, 500, 250, and 100 bp).

Figure 3. Precise detection of RT-PCR products in virus-containing water samples sterilized by ozone at different times. (A) The RT-PCR products of PV1 cDNA in the 5’-NCR synthesized with random primers.

  • The RT-PCR products of PV1 cDNA in the 5’-NCR synthesized with oligo-dT primers. Lanes 1-3 were positive controls, correspond to the amplification products of primer sets 5’-1/1F, 5’-2F/5’-2R, and 5’-3/1R, respectively. Lanes 4-6: Disinfection time of 30 s, lanes 7-9: Disinfection time of 60 s, lanes 10-12: Disinfection time of 90 s, lanes 13-15: Disinfection time of 105 s, lanes 16-18: Disinfection time of 120 s, lane 19-21 were negative controls. Lanes MA and MB, DL2000 DNA markers (2,000, 1,000, 750, 500, 250, and 100 bp).

Mappatura fine dei bersagli sensibili 5-NCR nel genoma PV1

Secondo quanto riferito, i test di ibridazione spot hanno una migliore sensibilità e l’effetto di rilevamento è ideale.

La sonda 2 è stata utilizzata per l’ibridazione spot.

Il metodo potrebbe rilevare 17 PFU / mL di RNA virale (Figura supplementare S2, disponibile su www.besjournal.com).

L’RNA virale è stato estratto da PV1 dopo la disinfezione utilizzando ozono per 0, 90, 105 e 120 s e il test di ibridazione spot è stato utilizzato per individuare con precisione i bersagli sensibili 5′-NCR nel genoma di PV1.

I loci 5′-NCR corrispondenti alla sonda 3 (80-124 nt) erano i più sensibili ai danni causati dall’ozono (Figura 4).

Inoltre, la perdita dell’integrità di questa piccola regione di 45 nt è stata accompagnata dalla perdita dell’infettività PV1 (Tabella supplementare S6, disponibile su www.besjournal.com).

Relazione tra perdita di infettività e danno genomico

DNA genomico PV1 e RNA privi di sequenze target differenti sono stati costruiti e verificati utilizzando RT-PCR (Figura supplementare S3, disponibile su www.besjournal.com).

Il test di formazione della placca dei corrispondenti genomi virali ricombinanti ha indicato che l’RNA genomico virale a lunghezza intera aveva un’elevata infettività (Figura 5), mentre il genoma virale privo delle regioni 80-124 nt e 1-124 nt non aveva infettività (Figura 6 ).

Figura 4. Saggio di ibridazione spot per determinare le regioni sensibili all’ozono nel 5′-NCR del genoma PV1 (n = 3). L’RNA PV1 è stato reticolato su una membrana e ibridato con sonde biotinilate mirate a diverse regioni. Il punto 5 corrisponde al controllo negativo. I punti 1-4 corrispondono all’RNA di PV1 trattato con ozono per 0, 90, 105 e 120 sec. I punti sono stati rilevati con sonde nella regione P1 (1-40 nt), P2 (40-80 nt), P3 (80-124 nt).

Figura 5. Analisi delle cellule che formano la placca utilizzando RNA genomico virale a lunghezza intera e particelle virali (n = 3). (A) Controllo negativo, nessun RNA PV1 è stato inoculato, (B) RNA virale integrato, (C) (C) Particella virale completa (17 PFU), (D) Particella virale completa (170 PFU).

Figura 6. Test delle cellule che formano la placca per determinare l’infettività dell’RNA PV1 ricombinante con bersagli sensibili eliminati (n = 3). RNA virale ricombinante è stato inoculato nel supernatante di coltura delle cellule Vero. (A) RNA privo di 1-124 nt di 5’-NCR, (B) è parallelo a,(C) RNA privo di 80-124 nt di 5’-NCR, (D) è parallelo a C.

Gli acidi nucleici virali non sono stati rilevati nei supernatanti della coltura da cellule inoculate infettate con virus ricombinanti, indicando la perdita di infettività quando mancavano le regioni 80-124 nt e 1-124 nt.

Gli acidi nucleici virali non sono stati rilevati nei supernatanti della coltura da cellule inoculate infettate con virus ricombinanti, indicando la perdita di infettività quando mancavano le regioni 80-124 nt e 1-124 nt.

L’ozono è un disinfettante efficace ed è ampiamente utilizzato per purificare l’acqua potabile [12].

In questo studio, abbiamo scoperto che l’effetto dell’ozono sull’infettività di PV1 era sia dipendente dal tempo che dalla dose e che PV1 poteva essere completamente eliminato dopo la disinfezione con ozono per 105 s.

È stato precedentemente segnalato che l’infettività di PV1 è completamente inibita durante il trattamento con 0,2 mg / L ClO2 per 12 min, 0,4 mg / L ClO2 per 8 min o 0,8 mg / L ClO2 per 4 min [22].

Ciò dimostra che l’ozono è più efficace come disinfettante del ClO2. Quando l’ozono viene utilizzato per disinfettare l’acqua potabile, anche la concentrazione di ozono necessaria è molto bassa.

Disinfettando l’acqua con ozono a una concentrazione di massa di 0,4 mg / L per 4 min, è possibile ottenere una disinfezione efficace [29].

Questi risultati indicano che l’ozono ha una prospettiva molto ampia come disinfettante per l’acqua.

I ricercatori hanno suggerito che l’ozono inattiva i virus distruggendo gli acidi nucleici virali o le proteine ​​del capside. Moore e Margolin hanno pubblicato uno studio in cui PV1 è stato trattato con cloro, ClO2, ozono e irradiazione UV per determinare l’efficacia di ciascun disinfettante e sono stati in grado di rilevare gli acidi nucleici virali anche dopo che l’infettività PV1 è stata completamente eliminata.

Hanno ipotizzato che l’inattivazione virale possa essere associata al danno alle proteine ​​del capside [30].

Tuttavia, Roy et al. ha scoperto che sebbene l’ozono possa distruggere la proteina del capside di PV1, l’infettività virale esiste ancora.

La distruzione dell’acido nucleico virale da parte dell’ozono è la ragione principale dell’inattivazione di PV1 [18].

Sebbene la maggior parte degli studi correlati indichi che l’inattivazione di PV1 indotta dall’ozono è associata a danni al genoma virale, le sequenze specifiche mirate all’ozono all’interno del genoma virale non sono state ancora identificate.

Qui abbiamo usato RT-PCR e test di ibridazione spot per identificare i siti di azione dell’ozono nel 5′-NCR del genoma virale.

I nostri risultati hanno indicato che il bersaglio genetico danneggiato dall’ozono si trovava principalmente nella regione 80-124 nt nel 5′-NCR.

Inoltre, il nostro modello di infezione ha confermato che l’RNA privo della regione 80-124 nt nel 5′-NCR ha causato la completa perdita di infettività.

I risultati ottenuti hanno anche dimostrato che gli acidi nucleici virali potrebbe essere rilevato dopo la completa eliminazione dell’infezione virale e che tutte le regioni rilevabili erano situate nella regione codificante del genoma virale, indicando che questa regione è più resistente all’effetto dei disinfettanti.

Simonet e Gantzer hanno anche riferito che il 5′- e 3′-NCR del genoma di PV1 sembravano essere i più sensibili al trattamento con ClO2 [31].

In uno dei nostri studi precedenti, Jin et al. ha determinato che il bersaglio genetico danneggiato da ClO2 nel 5′-NCR si trova principalmente nella regione 40-80 nt, con conseguente inattivazione di PV1 [22].

Per quanto riguarda altri enterovirus, Jin et al. ha riferito che ClO2 inattiva EV71 interrompendo la regione 1-118 nt nel 5′-NCR [5]; Li et al. ha anche determinato che la perdita dell’infettività HAV indotta da ClO2 è associata a danni al 5′-NCR [32].

Il 5′-NCR del genoma di PV1 è principalmente associato alla trascrizione, replicazione, traduzione e invasione virale [33].

La sequenza nucleotidica di questa regione contiene un alto grado di complementarità reciproca tra i fili, che supporta la formazione di strutture secondarie a forcina o stelo-loop.

Il 5′-NCR ha sei domini stem-loop, che rappresentano due elementi funzionali. Il dominio I è la regione 1-80 nt che è una struttura a quadrifoglio e associata alla replicazione degli acidi nucleici virali [34-35].

Questa regione è legata dalla proteina legante il poliC e dalla proteasi-polimerasi virale 3CD per formare il complesso ribonucleoproteico B [36], che catalizza la sintesi dell’RNA a filamento più dei virus.

I domini II-VI nella regione 130-610 nt sono associati alla sintesi proteica virale.

Definiti come un sito di ingresso ribosomiale interno, dirigono i ribosomi vicino al codone di inizio per la traduzione dell’RNA, migliorando l’efficienza della traduzione [33,37-38].

La struttura secondaria prevista dal software ha mostrato che la regione 80-124 nt è libera a filamento singolo e collegata al dominio II. Strutture secondarie interconnesse possono avere un’influenza decisiva sulla replicazione virale, che può essere attenuata durante il normale passaggio del virus a causa delle variazioni di alcune basi nella struttura secondaria a forcina o stelo [39].

L’eliminazione della regione della struttura dell’ansa può impedire al virus di moltiplicarsi [40].

Da un punto di vista energetico, l’energia fornita dall’ozono agisce sul filamento dell’acido nucleico e poiché i nucleotidi della regione a filamento singolo sono principalmente legati all’idrogeno a un livello di energia inferiore, l’energia necessaria per rompere il legame idrogeno a filamento singolo la connessione è minima.

Le rotture a filamento singolo libere tra i domini I e II possono causare rotture o mutazioni di base, portando ad alterazioni nella struttura secondaria.

La frammentazione di tali basi provoca direttamente la cancellazione del dominio I, causando la perdita di infettività virale.

I metodi tradizionali per rilevare i virus che coinvolgono la coltura cellulare sono complessi e richiedono tempo e, pertanto, non sono fattibili per valutare gli effetti genetici o molecolari sottili dei disinfettanti. I test di ibridazione spot e RT-PCR sono rapidi e scalabili, ma limitati nella loro capacità di distinguere tra virus attivi e inattivi [30].

Un paio di studi che hanno coinvolto l’uso della RT-PCR per determinare lo stato di PV1 dopo il trattamento con irradiazione UV, cloro, HCl e NaOH hanno riportato che gli acidi nucleici virali rilevati non corrispondevano alla perdita di infettività virale evidenziata nella coltura cellulare [41 -42].

Allo stesso modo, Lim et al. hanno riferito che i test RT-PCR a templato lungo e breve hanno notevolmente sottostimato l’entità dell’inattivazione del virus rispetto ai test di formazione della placca [43].

Di conseguenza, la maggior parte dei ricercatori ha ritenuto che, poiché le sonde RT-PCR o degli acidi nucleici non sono in grado di distinguere tra virus inattivi e attivi, questi metodi potrebbero sovrastimare l’infettività virale e non sono quindi adatti per una valutazione affidabile degli effetti dei disinfettanti.

Qui abbiamo ipotizzato che se l’inattivazione dei virus da parte dei disinfettanti è basata sul danno genomico virale, le tecniche di biologia molecolare dovrebbero essere in grado di valutare efficacemente gli effetti dei disinfettanti poiché queste tecniche dipendono strettamente dall’integrità degli acidi nucleici bersaglio, che sono usati come modello .

I ricercatori precedenti hanno rilevato solo frammenti di acido nucleico bersaglio nella regione codificante del genoma virale, mentre i nostri risultati suggeriscono che questa regione ospita la più forte resistenza ai disinfettanti. F

inoltre, studi precedenti hanno confermato che l’obiettivo dell’inattivazione di PV1 indotta da disinfettanti si trova nel 5′-NCR, piuttosto che nella regione codificante [31-32].

Pertanto, si presumeva che se le sequenze sensibili ai disinfettanti fossero state invece utilizzate come bersagli di rilevamento per virus inattivati, sarebbe stato possibile valutare l’effetto di disinfezione impiegando tecniche di biologia molecolare.

I risultati complessivi di questo studio supportano questa visione.

In conclusione, abbiamo valutato i meccanismi attraverso i quali l’ozono inattiva PV1 e determinato che l’inattivazione di PV1 da parte dell’ozono è associata a danni al genoma virale, piuttosto che alla proteina del capside.

 I nostri risultati indicano anche che i bersagli genomici sensibili all’ozono si trovano all’interno del 5′-NCR del genoma PV1.

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